Лабораторное занятие 1

Ход работы

1 Прочтите приведенное ниже краткое описание микроскопических методов, используемых для выявления вирусов в материалах (вирусоскопия в иммерсионном и люминес­центном микроскопах).

Вирусоскопия. В иммерсионном световом микроскопе об­наруживаются самые крупные элементарные тельца. Так, при натуральной оспе в жидкости кожных пузырьков находят вирионы Пашена, а в таких же везикулах при ветряной оспе – вирионы Арагана.

Легче при вирусных инфекциях выявить внутриклеточные включения (рисунок 8).

1 – тельца Гуарниери в клетке, зараженной вирусом оспы; 2 – включения в цилиндриче­ском эпителии, зараженном вирусом гриппа; 3 – включения в эпителии, зараженном реовирусом; 4 – тельца Бабеша-Негри в нейроцитах; 5,6 – внутриядерные включения в эпителии, зараженном герпес- и аденовирусом; 7 – внут­риядерные и цитоплазматические включения в эпителии, зараженном вирусом кори

По форме, размерам, структуре, отношению к кра­сителям вирусные вклю­чения строго специфичны. Например, тельца Гуарние­ри имеют округлую, серпо­видную или амебоидную форму диаметром 1–10 мкм, тельца Бабеша-Негри – овальные или эллипсоид­ные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов сер­повидные, наполовину охва­тывающие клеточное ядро, коревые включения – в виде почкующихся мелких дрож­жей (рисунок 9).

В препаратах, обработанных мечеными антителами под люминесцентным микро­скопом обнаруживают вне- и внутриклеточно расположенные вирионы в виде разноцветных точек и конгломератов в зависи­мости от природы используемого флюорохрома (рисунок 10).

Рисунок 9 – Тельца Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга

На сегодняшний день в ветеринарии применяется единственный информативный и достаточно точный метод диагностики бешенства у животных. Это посмертное исследование срезов аммоновых рогов головного мозга и обнаружение в них специфических включений – телец Бабеша-Негри. Состоят тельца Бабеша-Негри из тонковолокнистого матрикса и вирусного рибонуклеопротеида.

Рисунок 10 ― Вирус гриппа в культуре клеток через 12 ч после инфи­цирования (иммунофлюоресцентная микроскопия, ˟ 1200). Видны светящиеся комплексы в ядре и на внутренней поверхности плазмалеммы
2 Используя флюоресцентный микроскоп, рассмотрите препарат культуры клеток инфицированных вирусом и обработанных флюорохромом. Сделайте рисунок препарата и укажите светящиеся точки-вирусы.

3 Используя световой микроскоп, рассмотрите фиксированный препарат нейтроцитов с включениями рабдовирусов (тельца Бабеша-Негри). Сделайте рисунок препарата и укажите тельца Бабеша-Негри.

Ход работы

1 Ознакомьтесь с приведенной ниже общей характеристикой метода электронной микроскопии.

Электронная микроскопия. Теоретически разрешение просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,002 нм; реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. На практике разрешение для биологических объектов достигает 2 нм.

В электронном микроскопе ви­русы идентифицируют по тонким деталям их ультраструктуры. С этой целью получают микрофотографии. При этом содержащий вирусы материал суспендируют в хорошо испаряющейся среде и наносят на сетку с подложкой, представляющей собой пленку из коллодия или из чистого углерода, слабо поглощаю­щую электроны. Улучшение электронно-микроскопического изображения вирусов достигается увеличением их электронной плотности путем воздействия на них паров четырехокиси осмия. Широко используются также методы напыления на вируссодержащие материалы тяжелых металлов (золото, палладий, уран), хорошо оттеняющих форму и объем вирусных частиц, и нега­тивного контрастирования вирионов нейтральными растворами фосфовольфрамата или уранилацетата, глубоко проникающими в их «извилины и зазоры». Наконец, конфигурация вирионов от­четливо отпечатывается на матрицах-репликах высохших пле­нок пластмассы, раствором которых они заливаются. Симмет­рию и распределение белковых субъединиц в блоке-ансамбле вирусных кристаллов изучают с помощью рентгеноструктурного анализа.

Просвечивающий электронный микроскоп (рисунок 11) состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны наблюдают на флюоресцирующем экране и регистриру­ют при помощи фотопластинки.

Сканирующий (растровый) электронный микроскоп РЭМ применяют для получения трёхмерного изоб­ражения поверхности исследуемого объекта. В РЭМ применяются электронные линзы для фокусировки электронного пучка в пятно очень малых размеров. Это пятно непрерывно обегает некоторый участок образца аналогично лучу, обегающему экран телевизионной трубки. Электрический сигнал, возникающий при бомбардировке объекта электронами пучка, используется для формирования изображения на экране телевизионного кинескопа или электронно-лучевой трубки. Увеличение (отношение размера изображения на экране к размеру области, обегаемой пучком на образце) составляет от 10 до 10 млн.

Рисунок 11 – Внешний вид и схема электронного микроскопа

2 Рассмотрите электронные микрофотографии вирусов (рисунки 12-15, демонстрационный материал).

Рисунок 12 – Аденовирусы Рисунок 13 – Вирусы гепатита А

Рисунок 14 – Вирусы гриппа

Ход работы

1 Рассмотрите электронную микрофотографию вириона оспы (рисунок 16).

2 Изучите схему строения вируса натуральной оспы (рисунок 17) и найдите соответствия структурных элементов на схеме и фотографии.

3 Укажите на соответствующем рисунке протокола занятия сердцевину, капсид, суперкапсид вириона оспы и захваченные им фрагменты цитоплазматической мембраны.

Рисунок 15 – Электронная микрофотография фага эшерихии коли

Рисунок 16 – Вирион натуральной оспы ( электронная микроскопия, ˟ 230 000 )

Рисунок 17 – Схема строения вириона оспы:

1 – фрагмент цитоплазматической оболочки, захваченной вирионом при выходе из клетки; 2 – пространство между этой оболочкой и поверхностью вириона; 3 – внешняя осмиофильная мембрана оболочки вириона; 4 – сред­няя осмиофильная мембрана оболочки вириона; 5 – внутренняя мембрана обо­лочки вириона; 6 – боковое (лате­ральное) тело; 7 – фрагмент клеточной оболочки; 8 – внутривирусная гранула; 9 – локальное втяжение оболочки; 10 – тяж, связывающий компонент нуклеоида с оболочкой; 11 – вирусоплазма; 12 – внешняя осмиофильная мембрана обо­лочки нуклеоида; 13 – средняя осмиофобная мембрана оболочки нуклеоида; 14 – внутренняя осмиофильная мембра­на оболочки нуклеоида; 15 – нуклеоидоплазма; 16 – осмиофобный компонент S-образной структуры; 17 – кольцо – срез спиральной укладки ДНК (гипотеза); 18 – центр этого кольца; 19 – внутрен­ний компонент S-образной структуры нуклеоида; 20 – центральный компо­нент S-образной структуры нуклео­ида.

2.2 Фитовирусы

2.3 Методы выделения, культивирования и идентификации вирусов
2.1 Основные семейства

Вирусы отнесены к царству Vira. По типу нуклеиновой кислоты выделяют рибовирусы (РНК-вирусы) и дезоксирибовирусы (ДНК-вирусы). Для вирусов предложены следующие таксономические катего­рии (по восходящей): Вид (Species) → Род (Genus) → Подсемейство (Subfamilia) → Семейство (Familia). Категории подсемейств и родов разработаны не для всех вирусов.

Название всех вирусных родов оканчивается словом «virus», для названия семейств используется суффикс «-idae», а подсемейств − «-inae».

Из более чем 55 семейств вирусов, признанных Международным комитетом по таксономии вирусов, следующие 19 включают вирусы человека и животных: поксвирусы, иридовирусы, вирусы герпеса, аденовирусы, паповавирусы, вирусы гепатита В, парвовирусы, реовирусы, тогавирусы, коронавирусы, парамиксовирусы, рабдовирусы, филовирусы, ортомиксовирусы, буньявирусы, аренавирусы, ретровирусы, пикорнавирусы, калицивирусы.

К числу семейств вирусов исключительно позвоночных относят­ся Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae, Coronaviridae.

Размножаться в двух типах хозяев – позвоночных и беспозвоночных (клещи, комары, москиты) способны вирусы семейства Bunyaviridae, роды Alphavirus и Flavivirus семейства Togaviridae, вирусы родов Vesiculovirus и Lyssavirus семейства Rhabdoviridae, род Orbivirus семей­ства Reoviridae, вирус африканской лихорадки свиней семейства Iridoviridae. Такие вирусы составляют экологическую группу арбовирусов, т. е. вирусов позвоночных, передающихся членистоногими.

П



оксвирусы.

А – кирпичеобразная форма вириона; Б – вирус контагиозного моллюска

Вирион включает сердцевину, окруженную гладкой мембраной и слоем равномерно расположенных цилиндрических структур. Снаружи располагаются овальные структуры (белковые тела), окруженные оболочкой с характерной бороздчатой структурой. Геном – двухнитевая молекула ДНК.

Семейство включает вирусы осповакцины и натуральной оспы (род Orthopoxvirus), вирусы узелков доярок – псевдооспы крупного рогатого скота (род Parapoxvirus), вирус контагиозного моллюска (род Molluscipoxvirus) (рисунок 18 Б), вирусы оспы Тана и Яба – оспы обезьян (род Yatapoxvirus).

А Б

А – нуклеокапсид вирусной частицы  и отходящая на различное от него расстояние   оболочка формируют характерную картину «жарящегося яйца»; Б – модель вирусной частицы

Рисунок 21 – Вид аденовируса при электронной микроскопии (А) (˟ 600000 раз) и его модель (Б)

А Б
Рисунок 22 – Папилломавирус (А) и полиомавирус (Б) (электронная микроскопия)

Рисунок 23 – Схема строения генома вируса гепатита В

Рисунок 25 – Модель коронавируса

У человека коронавирусы вызывают поражения воздухоносных путей (рисунок 26) и желудочно-кишечного тракта.

Рисунок 27 – Схема строения вируса гриппа:

1 – спираль рNP; 2 – белки pV1, pV2, pA; 3 – гемагглютинин (500–600 шипов); 4 – нейраминидаза (100–160 шипов); 5 – матриксный белок; 6 – липидный бислой

Репликация ортомиксовирусов первично реализуется в цитоплазме инфицирован­ной клетки; синтез вирусной РНК происходит в ядре.

Наибольшую эпидемическую опасность представляют ви­русы гриппа А, вирус гриппа В вызывает локальные вспышки и эпи­демии, вирус гриппа С − спорадические случаи гриппа.

Буньявирусы. Семейство Bunyaviridae считается крупнейшим по количеству входящих в него вирусов (около 250). Вирионы буньявирусов имеют сферическую форму и диаметр 90–100 нм. Геном образован молекулой -РНК, состоящей из трех сегментов. Нуклеокапсид организован по типу спиральной симметрии. Снаружи нуклеокапсид покрыт двухслойным липидным суперкапсидом, на котором располагаются белковые структуры с гемагглютинирующей активностью, объединенные в форме поверхностной решетки.

В род Bunyavirus входят возбудители энцефалитов. Вирусы рода Phlebovirus вызывают различные москитные лихорадки. Род Nairovirus включает вирус Конго-крымской геморрагической лихорадки, вызывающей заболевания в России, Молдавии, Украине, на Балканах и в Африке.

Зрелые вирионы ВИЧ имеют сферическую форму, их размеры не превышают 100–120 нм в диаметре. Геном образуют две нити +РНК; их связывают белки р6 и р7 (цифра соответствует молекулярному весу в кД). Капсид образует белок р24. Сердцевина вириона име­ет цилиндрическую или конусовидную формы; её формируют белки р18 и р24. В сердцевине располагаются РНК, внутренние белки (р7 и р9), обратная транскриптаза и эндонуклеаза. Матричный белок р17 формирует прослойку между сердцевиной вириона и внешней оболочкой. Суперкапсид образован двойным липидным слоем, который про­низывают гликопротеиновые шипы. Каждый шип состоит из белков gp41 и gpl20 (рисунок 28).

Гликопротеины gp120 локализованы в выступающей части шипа и взаимодействуют с молекулами CD4 на мембранах клеток. Гликопротеины gp41 (белки слияния) располагаются внутри оболочки и обеспечивают её слияние с клеточной мембраной.

Пикорнавирусы. Семейство Picornaviridae [англ. pico, маленький и RNA – РНК] включает 4 рода: Enterovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphthovirus. Все представители этого семейства относятся к +РНК-содержащим вирусам. Молекула РНК нефрагментированная, заключена в икосаэдри-ческий капсид, построенный из 60 субъединиц и содержащий 4 уникальных полипептида. Характерной чертой является трансляция вирионой РНК в зараженной клетке с образованием единой полипептидной нити, «нарезаемой» в дальнейшем протеазами с образованием вирусоспецифических белков. Размножаются пикорнавирусы в эпителии желудочно-кишечного тракта и могут поражать эпителиальные клетки дыхательных путей.

Рисунок 28 – Схема строения вируса иммунодефицита человека

Калицивирусы. Род Calicivirus семейства Caliciviridae объединяет вирусы с «голым» кубическим капсидом диаметром 37–40 нм. Геном образован молекулой +РНК. При негативно-контрастной микроскопии на поверхности вирионов обнаруживают 32 чашечковидных вдавления, в связи с чем вирусы и получили свое название (греч. kalyx, чаша). Патогенные для человека виды вызывают гастроэнтериты и гепатиты.

Иридовирусы. Иридовирусы относятся к одноимённому семейству Iridoviridae и роду Iridovirus. В последний включены вирусы радужности насекомых. К семейству Iridoviridae, но к другому предполагаемому роду принадлежит ДНК-содержащий вирус африканской чумы свиней.

Вирусом африканской чумы свиней в природе инфицируются только свиньи (домашние и дикие виды) и мягкие клещи рода Ornithdoros (O. moubata – на юге Сахары в Африке, O. erraticus – в Португалии и Испании). Вирус передается среди клещей трансстадийно, трансовариально и половым путем. Свиньи инфицируются при укусах инфицированными клещами. Болезнь проявляется у домашних и диких европейских свиней.

Иридовирусы пойкилотерных животных выделены только от животных, имеющих водную стадию в цикле своего развития. Большинство иридовирусов насекомых предают синий или бирюзовый цвет инфицированным личинкам.

Вирион икосаэдральной симметрии. Вирусы животных имеют оболочку. Все иридовирусы содержат внутренние липидные мембрано-подобные структуры. Некоторые иридовирусы имеют многочисленные фибры, проходящие через икосаэдрон. Диаметр вирионов 130–170 нм. Это ДНК-геномные вирусы. Молекула ДНК линейная, двуспиральная. Геном иридовирусов позвоночных сильно метилирован.

Собственно вирусы беспозво­ночных представлены семейством Baculoviridae, подсемейством Entomopoxvirinae (семейство Poxviridae) и родами Densovirus (се­мейство Parvoviridae), Iridovirus (семейство Iridoviridae), вируса­ми насекомых семейства Rhabdoviridae, группой вирусов цитоплазменного полиэдроза (семейство Reoviridae) и группой энтеро-вирусов беспозвоночных семейства Picornaviridae.
2.2 Фитовирусы

Фитовирусы широко распространены в природе. В разных регионах Земли они поражают самые разнообразные виды растений: дикорастущие и возделываемые, одно- и много­летние, овощные и плодовые культуры, травянистые, кустарни­ки и деревья. Больше всего фитопатогенных вирусов выделено из цветковых растений, из папоротников и голосеменных – в редких (единичных) случаях. Размножаясь, фитопатогенные вирусы вызывают закукливание (рисунок 29 А), цветовую пестролистность, мозаику (рисунок 29 Б), скручивание (рисунок 30), бугристость и другие деформации листьев; локальный и диффузный их некроз; обезображивание плодов; задержку роста растений.

Рисунок 29 – Скручивание листьев хлопчатника (А) и мозаика пшеницы (Б)

Рисунок 30 – Скручивание листьев хлопчатника

Окончательная таксономия фитопатогенных вирусов далека от завершения, что во многом связано с трудностью их выращи­вания in vitro в протопластах клеток растений и однослойных культурах клеток насекомых-переносчиков, в которых не проис­ходит полный цикл их развития.

Лучше всего изучены вирусы экономически важных культур. Среди них выделяют две группы фитопатогенных вирусов: обычные классифицированные вирусы и вироиды [греч.-eides, подобные], или вирусоподобные агенты. Подавляющее большинство классифицированных вирусов растений – РНК-вирусы семейств рабдо- и реовирусов. Исклю­чение составляют изометрические вирусы (50 нм) мозаики цвет­ной капусты и мозаики георгины, содержащие обычную двухцепочечную ДНК и дефектные сателлиты вируса некроза табака и кольцевой пятнистости табака с неполноценным геномом, реп­ликация и созревание которых происходят только в присутствии родительского вируса-помощника.

Группа РНК-вирусов с полноценным геномом насчитывает около сотни видов. Большинство из них вирионы с одноцепочечной линейной цельной РНК. По морфологии их под­разделяют на три подгруппы: а) бациллярные (около 10 видов), отличающиеся таким же поперечником, как и у рабдовируса желтой карликовости картофеля, имеющего размеры 380˟75 нм; б) палочковидные (более 30 видов), поперечник которых не пре­вышает 18 нм, а длина варьирует от 300 нм, как у вируса табач­ной мозаики (ВТМ) и близких ему вирусов зеленой крапчатости мозаики огурца, кольцевой пятнистой орхидеи, мозаики подо­рожника и гороха, до 1250 нм, как у вирусов желтой свеклы и пятнистого некроза гвоздики; в) изометрические (более 30 ви­дов), в диаметре не превышающие 30 нм, типичными предста­вителями которых являются вирусы мозаики костра, крапчато­сти коровьего гороха, мозаики огурца, некротической кольцевой пятнистости сливы, кольцевой пятнистости табака, желтухи яч­меня, кустистой карликовости томата, желтой мозаики турнепса.

К вирусам с двухцепочечной сегментированной РНК относят вирус раневой опухоли, геном которого состоит из 11 фрагментов, сходные с ним вирусы карликовости кукурузы и риса, сахарного тростника островов Фиджи и измельченности початков кукурузы.

Классификация вирусов растений не поднялась пока выше создания родов. Кроме вирусов растений, вошедших в семейство Reoviridae (роды Phytoreovirus и Fijivirus), и рабдовирусов растений, насчитывается свыше 20 групп (родов) вирусов, поражающих высшие растения. Отли­чительной особенностью многих вирусов растений является раз­общенный геном, фрагменты которого находятся в различных вирионах. Для репликации таких ви­русов необходимо, чтобы в клетке присутствовали вирионы, несу­щие в сумме полный набор генома.

Фитовирусы, содержащие геномные РНК: Carlavirus – группа вируса латентной мозаики гвоздики, Comovirus – группа вируса мозаики коровьего гороха, Cucumovirus – группа вируса огуречной мозаики, Nepovirus – группа вируса кольцевой пятнистости табака, Potexvirus – группа ХВК (вирус Х картофеля), Tobamovirus – группа вируса табачной мозаики, Tobravirus – группа вируса погремковости табака, Tombusvirus – группа вируса кустистой карликовости томатов, Tymovirus – группа вирусов желтой мозаики турнепса, Closterovirus – группа вируса желтухи свеклы, Hordeivirus – группа вируса штриховатой мозаики ячменя, Luteovirus – группа вируса желтой карликовости ячменя, Ilarvirus – группа изометрических лабильных вирусов концевых пятнистостей.

Фитовирусы, содержащие ДНК: Caulimovirus – группа вируса мозаики цветной капусты.

2.3 Методы выделения, культивирования и идентификации вирусов

2.3.1 Культивирование вирусов

Вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно. Крупным достижением было предложение Р. Гудпасчура в 1932 г. использовать для культивирования вирусов куриные эмбрионы. Окончательное решение проблемы культивирования вирусов оказалось возможным лишь после того, как были разработаны основные способы культивирования клеток вне организма.

Использование куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы – практически идеальные модели для культивирования не­которых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проник­новению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирова­ния и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбу­дители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распозна­вать заболевание).

Для заражения обычно используют куриные эмбрионы 7–12-дневного возраста. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона путем овоскопирования (просматривают в проходящем свете). Живые эмбрионы при овоскопировании проявляют двигательную активность, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом очерчивают границы воздушной камеры.

Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим материалом в асептических условиях стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом. Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость, либо в желточный мешок (рисунок 29). Выбор метода заражения зависит от биологических свойств вируса.

Рисунок 29 – Схематическое изобра­жение развивающегося куриного эмбриона
Культура клеток. Вначале был использован метод переживающих тканей. Он заключался в том, что в колбу, содержащую питательную среду, вносили кусочек ткани. Клетки некоторых тканей в таких условиях могут пережи­вать (но не размножаться) до 30 дней, а в них могут размножаться вирусы. Однако этот способ давал очень небольшой выход вирусов. Необходимо было разработать условия, при которых клетки ткани могли бы свободно размножаться.

Для получения культур клеток необхо­димо было решить четыре главных задачи:

• 
  получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;
  
• 
  создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;
  
• 
  обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;
  
• 
  определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.
  

В 1949 г. Дж. Эндерс, Т. Веллер и Ф. Роббинс показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян. Основной недостаток первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после нескольких пересевов они перестают размножаться. Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бесконечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток (клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом) получают из опухолевых тканей (HeLa получена из карциномы шейки матки, НЕр-2 – из карциномы гортани; Детройт-6 – из метастаза рака легкого в костный мозг; RН – из опухоли почки человека) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромосом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких контаминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требованиям отвечают культуры диплоидных клеток.

Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие. В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя. Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.

2.3.2 Выделение вирусов

Выделение вирусов в культурах клеток. При выделении вирусов из различных инфекционных материалов (кровь, моча, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающих наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1–0,2 мл взвеси исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Выделение вирусов на лабораторных животных. При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили кле­точные культуры. Тем не менее животные модели активно используют для изучения особенно­стей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.

Таким образом, для выделения чистых культур вирусов в лабораторных условиях в настоящее время используются следующие живые объекты (биологические модели): 1) культура клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

2.3.3 Индикация вирусов

Индикация вируса в курином эмбрионе. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке.

Индикация вирусов в культурах клеток. Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить:

1) развитие специфической дегенерации клеток – цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: крупно- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток (гроздевидная дегенерация клеток).

Различают два механизма гибели клеток, вызываемой вирусами, – некроз и апоптоз. Некроз происходит из-за необратимых нарушений целостности клеточных мембран, апоптоз – вследствие фрагментации ядерной ДНК под действием клеточной эндонуклеазы.

Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью:

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гемагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс). Некоторые вирусы, в частности, вирус гриппа, обладают особыми рецепто­рами (гемагглютининами), с помощью которых они адсорбируются на эритроцитах и вызывают их склеивание (гемагглютинацию). Такие вирусы легко обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации или гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках куль­туры тканей);

4) феномен бляшкообразования. Широкое распространение получил предложенный в 1952 г. Р. Дюльбекко метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Чашки (флаконы) инкубируют при 37 °С. Через 48–96 ч выявляются пятна – бляшки. Они имеют диаметр 1–3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия вируса;

5) цветная реакция Солка. О росте вирусов в клетках можно судить с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый;

6) реакция интерференции (используется при отсутствии ЦПД, гемагглютинации и гемадсорбции): исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительна). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток могут быть использованы различные серологические реакции.

2.3.4 Методы идентификации вирусов

1. 
   нейтрализация цитопатического действия: в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1–2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус. При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим антителам примененной сыворотки;
   
2. 
   нейтрализация реакции гемадсорбции;
   
3. 
   изменение проявления цветной пробы;
   
4. 
   задержка (торможение) реакции гемагглютинации: смешивают культуральную среду, со­держащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.
   
5. 
   нейтрализация в опытах на животных.
   

1. 
   Назовите основные принципы классификации вирусов.
   
2. 
   Приведите русские и латинские названия основных семейств вирусов человека и животных.
   
3. 
   Назовите типовых представителей основных семейств вирусов и заболевания, вызываемые ими.
   
4. 
   Каковы особенности морфологии и ультраструктуры вирусов человека и животных (основных семейств)?
   
5. 
   Назовите РНК-геномные и ДНК-геномные фитовирусы.
   
6. 
   Какие этапы включают в себя лабораторные исследования при идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций?
   
7. 
   Какие биологические модели используются для выделения и культивирования вирусов человека и животных?
   
8. 
   Как происходит заражение куриных эмбрионов в лабораторных условиях?
   
9. 
   Какие методы получения культуры клеток вы знаете?
   
10. 
    Как проводят идентификацию вирусов в курином эмбрионе и на лабораторных животных?
    
11. 
    Какие существуют методы индикации вирусов на культуре клеток?
    
12. 
    В чем заключается назначение и сущность реакций нейтрализации вирусов?
    
13. 
    Назовите способы постановки реакций нейтрализации вирусов.